chromatographie d'échange d'ion

Publié le 9 oct. 2015 il y a 8A par Anonyme - Fin › 31 oct. 2015 dans 8A
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Sujet du devoir

 bonjour je ne comprend pas la correction d'un exercice

le voici :

 

soit un melange de deux oligopeptides A (Tyr-Asp-Arg-Cys) et B(Gly-Val-Thr-Trp-Cys)

on se propose de séparer  les peptides A et B par chromatographie d'échange ionique à partir d'une colonne de diéthylaminoéthyl-cellulose en partant d'un ph alcalin et en abaissant progressivement le ph.

-quel sera l'ordre d'elution des peptides à partir d'une colonne composée de carboxyméthylcellulose?

 

-cette methode  vous parait elle efficace pour séparer les deux peptides?

on donne : pkacooh =1,71

Asp : pka ch.laterale = 3.86

tyr: pka nh2=9.10

Gly: pka Nh2 :9.60

Arg : pka ch.laterale = 12.48

 

Où j'en suis dans mon devoir

je  ne comprend pas comment on resout cette exercice

j'ai la correction mais je ne comprend pas

dapres le professeur c'est le premier peptide  qui sera elué

pour resoudre cette exercice , le prof a  pris chaque acide aminé chargé de chaque peptide et à  diminué le ph au fur et à mesure puis il a mis les charge en fonction du ph de chaque acice aminé

par exemple : 0  -1  +1

mais je ne comprend pas cette methode avec les -1 et les +1  car pour chaque ph le prof a mis  des charges

 

cette exercice se repete assez souvent dans les examens j'aimerais donc comprendre comment on resout cette exercice avec la methode des charges .

 

 

merci d'avance




10 commentaires pour ce devoir


Anonyme
Posté le 9 oct. 2015

Bonjour,

Tu ne donnes pas les pka de certains acides aminés (cys et d'autres présents dans le peptide B) aussi je vais juste essayer de t'expliquer le principe.

Pour un acide aminé, le pka va déterminer le pH de séparation entre sa forme acide (chargée +) et sa forme basique (chargée-).

EXEMPLE :

-------------------------------|----------------------------------------> pH

     TYR +                            9,10          TYR -

Je pense que ton professeur a noté +1 la forme acide ; -1 la forme basique et 0 quand pH = pKa

Ainsi tu peux dessiner un axe de pH en plaçant les pka et les formes acides et basiques pour chaque acide aminé.

De cette façon, on sait quelle forme (+ ou -) de l'acide aminé est présente suivant le pH.

Pour le principe de la chromato :

tu as une résine carboxy... de pka = 1,71 donc elle est acide et contient des cations (forme +).

Quand tu mets tes peptides sur la résine, tu vas avoir certains acides sous forme + et d'autres -.

Quand tu mets l'éluant (en partant d'un pH basique) : les acides aminés vont avoir le choix entre rester accrocher à la résine ou se laisser entraîner par le liquide.

S'ils sont sous forme +, ils vont avoir une grande affinité pour la résine et vont s'y accrocher fortement. En revanche les - ne vont pas aimer la résine et vont se laisser entrainer vers le bas de la colonne.

Avec les pka que tu as donné, si on part d'un pH basique de 14, les acides aminés ARG, TYR et ASP sont sous forme - et vont être entrainé vers le bas de la colonne. Ils sont tous présents dans le peptide A.

Voilà j'espère que cela t'aidera un peu !

Bon courage

 

Anonyme
Posté le 9 oct. 2015

bonsoir

merci de votre reponse

mais je nai pas tres bien compris

en effet  ici il s'agit  dune colonne de carboxymethylcellulose dans un echangeur de cation chargé négativement donc la resine est chargé négativement

 

j'ai compris la notion d'élution grace a votre aide  c'est a dire que  si les aa sont chargés négativement  ils vont etre élués plus vite car il ny aura pas d'interaction electrostatique

seulement  ce que je en comprend pas c'est comment sais ton si l'aa est -1 ou +1 ?

dans le peptide A seul les aa asp et sont chargés

Anonyme
Posté le 9 oct. 2015

Oui je me suis mal exprimée.

La résine est chargée négativement donc elle va attirée les cations (ici la forme + des aa) qui vont se "fixer" dessus.

Effectivement des charges - se repoussent en électrostatique donc les aa - ne se fixeront pas et continueront leur chemin vers le bas.

Pour savoir si l'aa est -1 ou +1 il faut se servir de son pka.

 

Un acide aminé possède une fonction amine NH2 et une fonction acide carboxylique COOH.

 

En milieu acide le groupe NH2 devient NH3+  et le groupe carboxylique est sous forme COOH.

La forme acide sera donc notée +1  (à cause du NH3+).

On aura l'aa +1 pour un pH < pka

 

En milieu basique , on a le groupe NH2 et le groupe COO- d'où la notation -1 pour la forme basique de l'aa.

on aura la forme -1 pour un pH > pka

Si je reprends mon exemple avec la tyrosine :

-------------------------------|----------------------------------------> pH

     TYR +1                       pka=9,10          TYR -1

j'espère que c'est un peu plus clair.

Anonyme
Posté le 10 oct. 2015

 

 

 

 

bonsoir effectivement la je commence à comprendre merci

c'est un peu plus clair

mais pour mon exercice le prof a pris en consideration uniquement les aa asp et arg car dans le peptide A ce sont les seuls chargés

 

donc ce que j'ais fais c'est que j'ai fais ce quon me demande  j'ai abaissé le ph

du coup :

je part dun ph alcalin par exemple 14

                asp      arg

ph =14        -1      +1

ph=12,48    -1       0

ph=9          -1        +1

ph = 4          -1      +1

ph=3,86        0        +1

entre ces deux aa j'aurai tendance a dire que c'est  asp qui sort en premier car il ny aura pas dinteraction electrostatique avec le support . mais les charges nul me derange

car si je me souviens bien  quand la charge est nul c'est a ire quand le ph = pka l'aa est élué non?  dans ce cas la le zero apparaît pour arg donc ce serai arg en premier? c'est ici que je comprend pas

 ici on nous demande l'ordre delution des "peptides " dapres le prof il s'agit du peptide A

jai pas du tout compris pourquoi A

JE n'ai pas pu tout noté mais le prof a fait un tableau avec le petide A et les charges de chaque aa pour un peptide puis il a determiné le phi qui selon lui est de 6.48 pour le peptide A

et 5.66pour le B

heu par contre ici il sagit dune echangeuse danion qui est chargé positivement

je pense quil sagit du peptide A car si on abaisse le ph , le phi sera egal au ph en premier pour le peptide A

mais ce que je ne comprend pas c'est comment obtient t-on ces phi

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Anonyme
Posté le 11 oct. 2015

oui j'étais partie sur la résine carboxy.. qui est anionique et c'est vrai que je trouvais bizarre qu'on baisse le pH au lieu de l'augmenter.

Pour le calcul du phi d'un peptide c'est le même principe que pour le phi d'un AA qui est bien expliqué ici :

Pour le phi de l'AA : http://tutoweb.org/forum/topic/539-calcul-phi/

Maintenant pour le peptide A, voilà comment on trouve le phi de 6,48 :

on a les données des pka et celui de 1,71 correspond au groupe COOH de l'aa CYS.

Je trace une axe de pH et je place tous les pka.

                     1.71      3.86                9.10          12.48

                -----|----------|-------------|-------------|--------> pH

CYS           +    0      -       -        -         -       -         -      -

ASP           +    +      +      0        -        -        -         -       -

TYR           +    +      +      +       +        0       -          -      -

ARG          +     +     +      +       +        +        +       0      -

TOTAL    4+   3+   2+     +       0       -1       -2      -3     -4

 

Il faut repérer la forme de charge totale "0" pour le peptide.

ici la charge totale nulle se situe entre pka = 3,86 et pka = 9,10

il reste à appliquer la formule :

phi (peptide A) = (3.86 + 9.10)/2 = 6.48

J'ai tout noté avec des + et - au lieu de +1 et -1 pour que ce soit plus court :-)

Quand je valide mon post, les signes et les 0 sont un peu décalés mais les 0 sont bien placés à chaque fois au niveau du trait du pka car c'est là que l'aa change de signe.

 

Anonyme
Posté le 11 oct. 2015

olalala je crois que j'ai tres bien compris merci beaucoup !!!!!!!

l'histoire des charges je comprend beaucoup mieux !!

Anonyme
Posté le 11 oct. 2015

une fois calculés les phi alors on regarde la résine.

C'est une échangeuse d'anion et elle est chargée positivement.

Les peptides A et B sont chargés au global négativement à un pH élevé (pour le peptide A, j'ai trouvé une charge globale de 4- pour un pH>12,48) donc ils vont se fixer sur la résine.

Puis on diminue le pH. Quand le pH atteint la valeur du phi du peptide celui-ci se décroche car il a une charge globale nulle donc il n'est plus attiré par la résine et va descendre vers le bas de la colonne.

Le peptide qui sera récupéré en 1er ici sera celui dont le phi est le plus élevé (ici le A).

 

Raisonnement inverse avec une résine chargée négativement comme la carboxy.... Ici on partira d'un pH très acide puis on augmentera le pH. Dans ce cas là, ce sera le peptide de plus petit phi qui sera récupéré en 1er donc le B dans cet exercice.

Anonyme
Posté le 11 oct. 2015

daccord merci

moi ce que je retient c'est que on determine les phi

on sait que lorsque le phi est egale au ph le peptide descend

par consequent ici le phi de A est plus grand que celui de B  donc si on abaisse le ph , le ph atteindras en premier le phi du peptide A donc il seras elué avant lui.. je raisonne de la sorte

par contre ,  l'histoire des charge -4 global qui determine que le peptide est chargé négativement  ça je n'ai pas vraiment saisi

Anonyme
Posté le 12 oct. 2015

Bonsoir,

Je pense que tu as bien compris la démarche maintenant.

En ce qui concerne le total des charges -4, ce n'est pas important. J'avais juste comptabilisé tous les groupes du peptide qui avaient une charge - à un pH élevé.

La seule chose à retenir c'est qu'il est chargé négativement et que donc il est attiré par la résine chargée positivement.

bon courage :-)

Anonyme
Posté le 13 oct. 2015

daccord

merci beaucoup en tout cas pour votre aide!!!! :-)

 

 

 

par contre juste une petite chose , ici dans la question on nous delande a partir dune colonne composée de carboxy... donc chargé negativement donc on va augmenter le ph et se sera donc le peptide B qui sera elué en premier c bien ça?

 

laxe avec le ph et les pka doit toujours etre dans ce sens c'est a dire du plus petit ph/pka vers le plus grand ? on bien il est fonction de la charge de la resine?

ce que je veux dire par la c'est que suis a mon erreur , en effet dans la question on parle ici  dune echangeuse de cations (c'etais dans lenoncé lechangieuse d'anion) etant donné la petite erreur que nous avons faite (dinnatention) ya til un incidence sur la fleche de ph?

 


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