Respiration mitochondriale d'une fraction végétale

Sujet du devoir

Bonjour, Je suis en Licence biologie troisième année. Je vous explique ma situation: j'ai pratiqué un TP sur l'étude de la respiration mitochondriale mesuré par un oxymètre. Cependant, je rencontre des soucis pour faire le compte-rendu, je but sur certaines question dans la partie "Résultats" et j'ignore si ma partie "Matériel et méthode" est correct. En effet, je suis censé faire ce compte-rendu avec un binôme, mais comme je viens d'arriver en L3 et ayant peu de connaissances dans mon entourage, le binôme avec qui j'ai pratiqué ce TP ne parle pas bien le français et ne sait pas utiliser le matériel. Je me retrouve donc seul à faire ce compte-rendu. Voici le copié/collé des questions du compte-rendu avec le sujet suivant que je suis en train de travailler là-dessus jusqu’à la date limite. Je vous remercie d'avance pour votre aide Cordialement. POUR LE COMPTE-RENDU: L’ensemble ne devra pas dépasser 4 pages imprimées (police 12 points). Dans le compte-rendu apparaîtront : 1. Une introduction qui définira clairement les objectifs de cette expérience. Vous préciserez notamment, dans cette introduction, comment le NADH extramitochondrial chez les plantes peut faire entrer ses électrons dans la chaîne respiratoire ; un "matériel et méthodes" qui est un condensé synthétique mais précis des techniques utilisées indiquant toutes les données indispensables pour permettre à votre lecteur de reproduire l'expérience dans les mêmes conditions. 2. Une partie "résultats" qui doit raconter l’Histoire de cette expérience. La partie résultats est un texte illustré par des figures ou des tableaux. Elle doit être rédigée en excellent français. Les illustrations viennent en appui du texte. Vous les placerez en verso de la page en regard du texte et pas dans le texte. Elle présentera une description puis un commentaire précis de chacune des différentes phases des tracés, un tableau général récapitulatif des différentes vitesses exprimées en µmole d’O2 . mn-1. mg-1 calculées pour chaque tracé. (Le détail d’un calcul suffira).Vous déterminerez la valeur du contrôle respiratoire. Le rapport ADP/O pour chacun des substrats testés (NADH et succinate) sera calculé. Vous comparez vos différentes valeurs les unes par rapport aux autres et vous les discuterez et les expliquerez en vous aidant de vos connaissances. 3. Vous exploiterez vos données pour préciser l’effet qu’exerce le CCCP et l’antimycine A. Vos enregistrements devront être annotés de façon à bien indiquer ce qui a été ajouté aux différents temps de l’expérience. Pour le calcul des rapports ADP/O, par un trait au crayon, vous devrez faire apparaître clairement, sur le tracé d’oxymétrie, le O2 que vous avez utilisé pour vos calculs. Les tracés devront être apprétés pour en faire de véritables figures et seront donc considérés comme telles. La note qui sera donnée sera le reflet non pas des valeurs arithmériques absolues obtenues mais de l’interprétation intelligente et scientifique des données expérimentales. On tiendra compte également de la facilité qu’aura eu le lecteur de comprendre l’exploitation des résultats. Enfin, les consignes évoquées dans le cadre de l’unité Initiation à la rédaction scientifique devront être respectées. Cet aspect-là sera également pris en compte. Sujet TP: I- INTRODUCTION La respiration mitochondriale permet la synthèse d'ATP par phosphorylation de l'ADP. Cette formation d'ATP est couplée au transfert d'électrons provenant de l'oxydation de substrats tels que le succinate ou le malate. Les électrons sont d'abord transférés au NADH ou FADH2 puis, par une série de transporteurs d'électrons, sur l'O2 (ultime accepteur d'électrons). L'O2 est alors réduit en H2O. Les mitochondries sont dites couplées lorsque les réactions d'oxydoréduction de la chaîne des transporteurs d'électrons et la phosphorylation de l'ADP en ATP sont indissociables. Ainsi, lorsqu'il y a dans le milieu tous les substrats de la chaîne respiratoire et de l’ATP synthase, c'est l'état 3. Lorsque l'ADP devient insuffisant, c'est l'état 4. II- ISOLEMENT DES MITOCHONDRIES Le facteur "temps mis pour isoler les mitochondries" est le facteur déterminant pour l'obtention de mitochondries couplées. Assurez-vous que tout soit prêt (solutions prêtes, centrifugeuse froide, solution KOH 1M disponible, pHmètre calibré, balances libres, barreau aimanté trouvé, pipette Pasteur équipée d'une poire disponible, vitesse et temps de centrifugation connus,…) Toutes les opérations se déroulent au froid. Toutes les solutions et les fractions sont maintenues dans la glace. - Epluchez environ 100g de pommes de terre, les raper dans 100 ml de tampon d'extraction contenant PVPP insoluble, BSA et cystéine. - Broyez les pommes de terre pendant 3 secondes à vitesse lente dans un broyeur à hélice, puis filtrez le broyat immédiatement sur une toile à filtrer en récupérant le filtrat dans un bécher de 500 ml placé dans la glace. Ajustez le pH à 7,2 avec KOH 1N. - Attendez 2 min (sédimentation de l'amidon) avant de centrifuger en maintenant le filtrat dans la glace. Versez délicatement le filtrat dans un pot de centrifugation de 250 ml (ou dans 2 tubdes de 80 ml) sans trop entraîner d'amidon. - Centrifugations : 1 500 g, 10 min. Récupérer le surnageant puis deuxième centrifugation: 12 000 g, 20 min. - Eliminez le surnageant et lavez délicatement la surface du culot C2 sans le remettre en suspension. Pour ce faire, ajouter 2 ml de milieu de lavage sur le bord des tubes puis tourner doucement les tubes à la main. Les mitochondries lavées sont reprises avec le milieu de mesure contenant de la BSA, dans un volume final de 1 ml. Remettez délicatement les mitochondries en suspension en utilisant un petit potter équipé d'un piston en Téflon et en évitant de faire mousser la suspension. III. MESURE DE LA CONSOMMATION EN OXYGENE: Réalisation de l'électrode de Clark Sortez l'électrode de la cellule de mesure. Enlevez le joint en caoutchouc et éliminez la membrane de téflon qui couvre la pointe de l'électrode. Déposez dessus une goutte de KCl ½ saturé puis un morceau de papier à cigarette et enfin une nouvelle membrane de 1 cm2. Fixez la membrane de téflon avec le joint sur l'électrode. Reconstituez la cellule de mesure. Etalonnage de l'oxymètre : faire le Zero... Mesures oxygraphiques : Le tampon sera maintenu dans un bain thermostaté à 20°C. Les substrats seront maintenus dans la glace. La cellule de mesure sera thermostatée à 20°C. Mettez, dans la cellule de mesure, le milieu de mesure et les mitochondries (voir volumes ci-après). Après chaque mesure, la cellule sera vidée et lavée. Une série de 4 mesures devra être réalisée comme suit. - Oxydation des substrats : NADH puis succinate : Contrôle respiratoire. Rapport ADP/O Mesure 1 : - Milieu de mesure 1,9 ml - Mitochondries 0,1 ml Enregistrez la respiration de base - Substrat (NADH ou succinate) 20 µl Enregistrez - ADP 20 mM 5 µl Enregistrez Mesure 2 : - Milieu de mesure 1,9 ml - Mitochondries 0,1 ml Enregistrez la respiration de base - Substrat (NADH ou succinate) 20 µl Enregistrez - ADP 20 mM 10 µl Enregistrez - Action du CCCP - milieu de mesure 1,9 ml - Mitochondries 0,1 ml - NADH 0,1M 20 µl Enregistrez - CCCP 2 mM 10µl Enregistrez - ADP 20 mM 10µl Enregistrez - Action de l'antimycine. - milieu de mesure 1,9 ml - Mitochondries 0,1 ml - NADH 0,1M 20 µl - ADP 20 mM 40 µl Enregistrez - Antimycine A 2mM 10µl Enregistrez - Ascorbate 0,5M + cytochrome C 3mM + TMPD 20µl chacun Enregistrez IV. DOSAGE DE PROTEINES Sur une partie de la fraction mitochondriale, un dosage de protéines est effectué selon la méthode de Lowry par rapport à une gamme étalon réalisée avec la BSA (Bovine Serum Albumin). Préparez une gamme comprenant de 0 à 100 µg de BSA/tube à l'aide d'une solution de BSA à 1 mg/ml. Préparez les tubes à hémolyse de la manière suivante : - Protéine : soit le volume adéquat de BSA 1 mg/ml, soit 25 et 50l de la fraction mitochondriale (diluée d'un facteur 10 dans H2O). Pensez également à doser le tampon seul (qui contient de la BSA !) dilué comme la fraction mitochondriale. - 50 µl de SDS 10% - H2O qsp 200µl Ajoutez 1 ml de réactif (A + B + C) préparé extemporanément à partir des solutions suivantes, - A : Na2CO3 2% dans NaOH 0,1N : 49 ml - B : CuSO4 1% : 0,5 ml - C : Tartrate de sodium et potassium 2% : 0,5 ml Mélangez correctement par agitation au vortex. Incubez les tubes 10 min à température ambiante. Puis, additionnez 0,8 ml de Folin dilué. Mélangez. Après une incubation de 30 min à température ambiante, lisez l'absorbance des tubes à 550 nm. Tracez la courbe étalon et déterminez la concentration en protéines de la fraction mitochondriale. Pour éliminer les équivalents protéines apportés par le tampon, vous corrigerez la valeur de la concentration et non pas la valeur de l’absorbance. ANNEXES TABLEAU "The oxygen content of air saturated water" Temp. (°C) O2 (ppm) O2 (µmole/ml) 0 14,16 0,442 5 12,37 0,386 10 10,92 0,341 15 9,76 0,305 20 8,84 0,276 25 8,11 0,253 30 7,52 0,230 35 7,02 0,219 MILIEUX Milieu de base : Mannitol 330mM, Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM pH 7,4 : disponible Milieu d'extraction : Milieu de base + cystéine 4 mM, Sérum-albumine 0,1%, PVPP insoluble 0,6%. Ajustez le pH du milieu à 7,4. Milieu de lavage :Milieu de base, Sérum-albumine 0,1%, pH du milieu à 7,2. Milieu de mesure : Mannitol 330 mM, KH2PO4, 10 mM pH 7,2, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, BSA 0,5%. Maintenez à 20°C pour les mesures. SOLUTIONS Succinate, 1Na, 6H2O 500 mM NADH, 2Na 100 mM ADP, 2Na 20 mM Ascorbate, 2Na 500 mM Cytochrome C 3 mM TMPD Dissous dans l'éthanol pur CCCP 2 mM Antimycine 2 mM

Où j'en suis dans mon devoir

Où j'en suis : Introduction: La chaîne respiratoire permet de réoxyder les coenzymes NADH et Ubiquinone réduits au cours du cycle de Krebs. Cette réoxydation s'accompagne de la création d'un gradient transmembranaire de protons qui va servir à fabriquer de l'ATP. La mitochondrie est un organite dans les cellules eucaryotes et limitée par deux membranes de propriétés très différentes : une membrane externe contenant une protéine transmembranaire. Une membrane interne très riche en protéines et quasiment imperméable aux ions et aux métabolites hydrosolubles. Chez les végétaux, Il existe des enzymes supplémentaires spécifiques de la chaîne respiratoire : Une NADPH déshydrogénase Ca2+ dépendante interne sur la face matricielle. Elle oxyde le NADPH matriciel provenant du cycle de Krebs, lorsque celui-ci est très élevé dans la matrice. Une NADPH déshydrogénase externe : elle est orientée vers le cytosol. L’objectif de ce TP est d’étudier le fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale végétale. La chaîne est localisée dans la membrane interne mitochondriale et est constituée de quatre complexes protéiques enzymatiques : complexe I : NADH-ubiquinone réductase complexe II : succinate ubiquinone réductase complexe III : Ubiquinone-cytochrome C réductase complexe IV : cytochrome c oxydase Pour comprendre le fonctionnement de la chaîne respiratoire, nous utiliserons un oxygraphe pour suivre l'évolution de la concentration en oxygène au cours du temps en présence de différents substrats Matériel et méthodes: *Préparation de la suspension mitochondriale: A partir d’un échantillon de pommes de terre que nous avons râpés dans un mélange de tampon d’extraction contenant un mélange de PVPP, BSA et cystéine, nous les avons broyés en utilisant un broyeur à hélice durant une durée de 3 secondes à vitesse lente. Ensuite nous avons filtré le broyat sur une toile à filtrer et récupéré le filtrat dans un bécher de 500ml placé dans la glace et ainsi ajusté le pH à 7,2 avec une solution de KOH 1M à l’aide d’un pH mètre. Après une série de centrifugations : La première centrifugation a été réalisée dans une centrifugeuse à 1500g durant 10min, nous avons récupéré le surnageant pour le re-centrifugé à 12 000g durant 20 min et récupéré le culot, puis le lavé avec une solution de lavage. Enfin, nous avons repris les mitochondries ainsi lavé dans un milieu de mesure contenant de la BSA dans un volume final de 1ml puis remis en suspension en utilisant un petit potter *Mesure de la concentration en O2: Nous avons réalisé l’électrode de Clark en utilisant une cellule de mesure, une goutte de KCl et un morceau de téflon au niveau de la pointe des éléctrodes. L’étalonnage de l’oxymètre consiste de faire le Zero en oxygène nécessitant un milieu dépourvu d’O2 en utilisant une pointe de spatule de dithionite de sodium dans la cellule contenant 2ml d’eau pure. Ensuite réglé l’oxygraphe de sorte que le crayon soit au niveau de la ligne de base. (?) *Dosage des protéines par colorimétrie avec la méthode de Lowry : Dans un premier temps, nous avons préparé la solution de réactif à 50mL contenant 49ml de Na2CO3 2% dans NaOH 0,1N ; 0,5mL de sulfate de cuivre à 1% et puis 0,5ml de Tartrate de sodium et potassium 2%. Dans un second temps, nous avons réalisé une gamme étalon de 11 tubes à essai de quantités croissantes et connues choisies comme référence de 0 à 100µg de BSA/tube avec une solution de BSA à 1mg/ml. De plus, chaque tube contient 50µL de SDS et ?? de protéines. Le volume total pour chaque tube est de 200µl complété avec de l’eau distillée. Et enfin, nous avons ajouté 1ml de réactif préparé précédemment dans chaque tube. Puis mélangé chaque tube. Nous avons opéré les tubes à l’incubation à température ambiante durant 10min, puis additionné 0,8mL de folin dilué et agité les tubes. Et enfin incubé à nouveau les tubes pendant une durée de 30min pour ensuite lire l’absorbance des tubes à 550nm Résultats : Tout d’abord, nous avons procédé à l’extraction des mitochondries à partir d’épluchures de pommes de terre et ensuite introduit l’homogénat dans la cellule de mesure de l’oxymètre permettant de mesurer la consommation d’O2 au cours du temps. Les mitochondries se trouvent dans un milieu tampon et à froid ce qui permet d’éviter les variations du pH et donc d’éviter la désagrégation de nos mitochondries. Il s'agit d'un appareil de mesure qui utilise une électrode à dioxygène constituée par une cathode et une anode reliée par une solution conductrice. L'ensemble est séparé du milieu par une membrane imperméable à l'eau et aux ions mais perméable au dioxygène dissout. L'électrode est polarisée. Nous avons enregistré le courant électrique généré. L'intensité du courant est proportionnelle à la quantité d'oxygène dissoute dans le milieu. Nous pouvons ainsi suivre la consommation d'oxygène qui est l'accepteur final de la chaîne respiratoire. Grâce aux tracés obtenus nous pourrons calculer la pente et donc en déduire la vitesse de la réaction. 1) Oxydation des substrats et rapport ADP/O Dans cette expérience nous avons introduit dans la cellule de mesure, 1,9ml de milieu de mesure, 100µl de mitochondries, 20µl de substrat (Succinate ou NADH) et avec 5 à 15µl d’ADP afin d’observer l’évolution d la consommation d’oxygène. Mesure 1 : Présence de Succinate : D’après la courbe ci-dessous, nous observons une pente d’allure non négligeable et de courte durée. A partir de l’ajout de 5µl d’ADP, la courbe s’infléchit, donc la consommation d’oxygène s’accroit légèrement. A 10µl d’ADP, la consommation devient plus importante et diminue ensuite lorsque tout l’ADP présent est consommé. A 15µl d’ADP, nous observons une nette consommation de dioxygène car l’allure de la courbe devient plus infléchie et puis à nouveau une diminution de l’activité de la chaine respiratoire lorsque l’ADP est consommé. (cf figure) Mesure 2 : présence de NADH : D’après la courbe ci-dessous, nous observons comme pour le succinate une pente d’allure non négligeable et de courte durée, donc une consommation d’oxygène par les mitochondries. Lorsque nous avons ajouté 10µl d’ADP, la courbe s’infléchit et donc la consommation d’O2 augmente. (cf figure) 2) Action du CCCP D’après la courbe suivante, les mitochondries en présence de NADH entraine l’activation de la chaine respiratoire comme observé précédemment. En présence de CCCP, nous observons une nette augmentation de la vitesse de la chaine respiratoire car la consommation d’O2 augmente significativement. La présence d’ADP ne change rien à la vitesse de consommation (cf figure) 3) Action de l’antimycine A Le NADH et ADP en présence d’antimycine A entraine l’arrêt de la chaine respiratoire car la consommation de dioxygène est stoppé. Lorsque nous avons ajouté une solution d’ascorbate 0,5M, cytochrome C 3mM et TMPD 20l, la chaine respiratoire fonctionne à sa vitesse maximale. (cf figure) Dosage des protéines: ... Discussion et conclusion : D’après nos résultats obtenus précédemment. Nous pouvons déduire que le Succinate et le NADH sont des activateurs de la chaîne respiratoire. Les électrons portés par le succinate pénètrent dans la chaine respiratoire via le complexe II, et que les électrons portés par le NADH entrent dans la chaine respiratoire via le complexe I. Ces électrons sont transférés jusqu’au complexe IV ou l’oxygène est réduit en eau. En effet, en présence d’un substrat (NADH ou succinate), la chaine respiratoire se met en route et crée un gradient électrochimique de proton mais qui a tendance à s’accumuler dans l’espace intermembranaire et donc faire ralentir l’activité de la chaine respiratoire, car si le gradient est trop élevé, la chaine respiratoire ne peut plus exporter les ions H+. En effet, l’ajout de l’ADP active la pompe ATPase qui est indispensable pour limiter la valeur du gradient électrochimique des ions H+ en les transportant dans la matrice, et ainsi faire repartir la chaine respiratoire à sa vitesse maximale. Il y a donc un équilibre nécessaire entre l’exportation et l’importation des ions H+ Le CCCP agit sur le fonctionnement de la chaine respiratoire, de la même manière comme si on ajoutait de l’ADP car il augmente sa vitesse. Nous pouvons faire l’hypothèse qu’il dissipe artificiellement le gradient de protons et il n'y a plus synthèse d'ATP, le transfert des protons H+ s’opère de manière indépendante de la pompe ATPase et la rend inutile. Le transfert d'électrons et la consommation d'O2 sont à leur maximum. Le CCCP est un composé lipidique faiblement acide et c’est un agent découplant très fort. L’antimycine A agit comme un inhibiteur. Mais la présence d’ ?? permet de refaire fonctionner la chaine respiratoire. En effet, on peut faire l’hypothèse que c’est un inhibiteur du complexe III de la chaine respiratoire car le complexe IV fonctionne grâce à la présence de cytochrome C, qui impose la vitesse à la chaine respiratoire. Toutefois, Nous pouvons ajouter que le complexe IV de la chaine respiratoire impose son timing car c’est le dernier complexe. S’il avait été inhibé par un inhibiteur, la chaine respiratoire serait inhibé quelque-soit l’activité des autres complexes.